兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù)研究進(jìn)展

單克隆抗體由于其高特異性和親和力而廣泛用于治療、診斷和生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。目前，大多數(shù)針對(duì)人類抗原的單克隆抗體（mAb）是在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的，小鼠單克隆抗體（MMA）已在診斷和治療環(huán)境中得到廣泛應(yīng)用。然而，已經(jīng)報(bào)道了使用MMA作為人類免疫治療劑的許多弊端，包括血清半衰期短和誘導(dǎo)人類抗小鼠抗體反應(yīng)。此外，許多人類免疫原無法刺激小鼠產(chǎn)生抗體反應(yīng)。這些缺點(diǎn)限制了MMA在治療和診斷應(yīng)用中的使用。

與傳統(tǒng)的MMA相比，兔單克隆抗體更適合用于研究和診斷。兔單克隆抗體表現(xiàn)出多種綜合優(yōu)勢(shì)，包括對(duì)抗原的高親和力、特異性、更多樣化的表位識(shí)別，以及對(duì)小尺寸表位和小鼠抗原反應(yīng)的大幅改善。此外，兔子在進(jìn)化上與小鼠相距甚遠(yuǎn)，兔子可以針對(duì)某些在小鼠體內(nèi)沒有免疫原性的抗原產(chǎn)生抗體。這些優(yōu)勢(shì)使兔單克隆抗體成為人類疾病小鼠模型中極具吸引力的診斷試劑。與小鼠mAb類似，兔mAb也顯示出一些局限性，包括在人類中誘導(dǎo)免疫原性。為了降低免疫原性并促進(jìn)兔單克隆抗體用于治療應(yīng)用，嵌合化、人源化和Fc工程等抗體工程方法被成功應(yīng)用。之前的兩項(xiàng)研究表明，人源化兔單抗保留了對(duì)人類抗原的高特異性和親和力，可用于診斷應(yīng)用。此外，兔單克隆抗體和MMA對(duì)幾種腫瘤類型的比較研究表明，兔單克隆抗體顯示出更高的靈敏度，而沒有明顯的特異性損失。因此，兔免疫系統(tǒng)是產(chǎn)生針對(duì)人類抗原的治療性人抗體的重要來源，兔單克隆抗體在藥物和診斷中具有高親和力和特異性的優(yōu)勢(shì)。隨著抗體功能和庫分析的進(jìn)步，人源化兔單克隆抗體未來將在治療應(yīng)用中得到廣泛應(yīng)用。

獨(dú)特的兔抗體庫發(fā)育機(jī)制

兔免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體多樣性，并通過與小鼠和其他嚙齒動(dòng)物不同的機(jī)制優(yōu)化親和力。與傳統(tǒng)鼠單克隆抗體相比，兔單克隆抗體在診斷方面具有優(yōu)勢(shì)，對(duì)抗原的親和力和特異性高，表位識(shí)別更多樣化，對(duì)小表位和小鼠抗原的反應(yīng)大幅提高。兔免疫球蛋白重鏈（IGH）基因座包含200多個(gè)IGH可變種系基因，其中超過50%被發(fā)現(xiàn)是“無功能的”。此外，通過基因組測(cè)序（IMGT數(shù)據(jù)庫）鑒定了超過50個(gè)IG Kappa V和17個(gè)IG Lambda V功能基因。大多數(shù)兔抗體源自IGHV1基因，雖然兔VH庫的多樣性有限，但VL庫比小鼠和人類更多樣化。兔VL庫顯示出比其人類和小鼠更長(zhǎng)的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）-L3環(huán)。

最近，使用二代測(cè)序（NGS）技術(shù)分析了全面的兔抗體庫。在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)IGHV1S40和IGHV1S45主導(dǎo)了幼兔的VH庫，而IGHV1S69對(duì)用16聚體肽免疫的兔有顯著貢獻(xiàn)。此外，兔VH和VL的體細(xì)胞突變高于人類和小鼠，VH區(qū)域比人類和小鼠多三分之二的突變，而VL區(qū)域在片段區(qū)域（FR）-1和FR-3中積累的突變更多。兔CDR-H3的平均長(zhǎng)度為12個(gè)氨基酸，與人類和小鼠相似，而CDR-L3的長(zhǎng)度比人類和小鼠長(zhǎng)得多。兔免疫系統(tǒng)同時(shí)使用基因轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞超突變來使抗體庫多樣化，與人類和小鼠相比，兔抗體庫中的更多突變可以彌補(bǔ)用于構(gòu)建功能庫種系基因的限制。

兔單克隆抗體開發(fā)技術(shù)

單克隆抗體（mAb）是生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中必不可少的工具。mAb療法以越來越快的速度徹底改變了許多嚴(yán)重人類疾病的方法，在過去的十年中，已經(jīng)開發(fā)出許多用于分離兔單克隆抗體的技術(shù)。

2017年初，超過230種mAb在階段臨床研究中得到評(píng)估。存在許多用于研究和治療目的的mAb生成和鑒定方法。1975年Kohler和Milstein描述的小鼠雜交瘤方法是第一個(gè)也是最廣泛使用的獲得小鼠mAb的方法。在過去的幾十年中，噬菌體展示、酵母表面展示、核糖體展示和mRNA展示技術(shù)已被用于生產(chǎn)mAb。盡管這些抗體生成技術(shù)被廣泛用于mAb篩選，但這些方法效率低下且需要耗時(shí)的操作。此外，抗體的天然同源配對(duì)信息在展示方法中丟失，降低了抗體的特異性多樣性。

最近，開發(fā)了一種基于單B細(xì)胞的方法，從單個(gè)B細(xì)胞或單細(xì)胞的克隆擴(kuò)增后代直接取樣免疫組庫，避免了低效的雜交瘤融合步驟，并保留了天然的重鏈和輕鏈配對(duì)。此外，該技術(shù)利用了mAb的親和力、特異性和穩(wěn)定性特征的天然過程。通過FACS或手動(dòng)顯微操作從抗原特異性記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞，抗體基因被轉(zhuǎn)移到原核、真核或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)重組兔單克隆抗體。單B細(xì)胞抗體技術(shù)平臺(tái)已被證明是高效和穩(wěn)健的，可以在短時(shí)間內(nèi)從免疫兔中產(chǎn)生大量抗原特異性重組抗體，從而促進(jìn)了兔單克隆抗體的生產(chǎn)。

1.雜交瘤技術(shù)

小鼠雜交瘤技術(shù)依賴于B細(xì)胞與骨髓瘤伴侶的細(xì)胞融合，自1975年被鑒定以來，廣泛地用于小鼠單克隆抗體的生產(chǎn)（圖1）。該方法采用免疫小鼠的淋巴細(xì)胞與源自BALB/c小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成永生化雜交瘤細(xì)胞。然后，篩選雜交瘤細(xì)胞以鑒定產(chǎn)生相同抗體的特定克隆（圖1）。兔單克隆抗體于1988年首次報(bào)道，采用小鼠-兔異源雜交瘤方法。然而，這種小鼠-兔異源雜交瘤效率相對(duì)較低、不穩(wěn)定，并且無法長(zhǎng)時(shí)間分泌抗體。在20世紀(jì)90年代中期，產(chǎn)生了穩(wěn)定的兔-兔雜交瘤以生產(chǎn)兔單克隆抗體。這些兔-兔雜交瘤也被證明不如傳統(tǒng)的小鼠雜交瘤穩(wěn)定，這限制了它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室水平上的廣泛使用。此外，由于低效融合（傳統(tǒng)聚乙二醇融合的效率為5×10^-6）和轉(zhuǎn)化事件，雜交瘤技術(shù)在兔單克隆抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。

注：（A）小鼠雜交瘤技術(shù)；（B）噬菌體展示技術(shù)；（C）單B細(xì)胞抗體技術(shù)。

圖1. 抗原特異性單克隆抗體開發(fā)流程

雜交瘤技術(shù)是一種成熟的小鼠單克隆抗體生成方法，廣泛用于生產(chǎn)各種抗體。由于缺乏合適的骨髓瘤伴侶，雜交瘤方法主要限于嚙齒動(dòng)物免疫。在20世紀(jì)80年代，開發(fā)了一種用于生產(chǎn)治療性抗體的人類雜交瘤技術(shù)，該技術(shù)允許以天然形式產(chǎn)生天然人類抗體。這種人類雜交瘤技術(shù)開發(fā)了另一種無需額外修飾即可產(chǎn)生治療性抗體的有效方法。許多研究致力于這項(xiàng)技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)了幾種有用的人類融合伴侶細(xì)胞系?；诟玫娜诤习閭H的開發(fā)和電融合技術(shù)的進(jìn)步，人類雜交瘤融合的成功率得到提高，這可以在不久的將來促進(jìn)治療性抗體的開發(fā)。此外，有一種基因修飾方法，通過過度表達(dá)BCL-6和BCL-XL使人類B細(xì)胞永生化。使用這項(xiàng)技術(shù)分離出了許多針對(duì)多種致病病毒的單克隆抗體。該技術(shù)還成功應(yīng)用于其他物種，從永生化記憶B細(xì)胞中高效生成了兔單克隆抗體。

2.噬菌體展示技術(shù)

從1990年代初開始，噬菌體展示技術(shù)被探索為一種產(chǎn)生mAb的新方法。在這種方法中，從淋巴細(xì)胞中收集V基因庫，并通過融合到絲狀噬菌體的外殼蛋白來克隆和表達(dá)VH和VL的組合（圖1）。然后，選擇在其尖端帶有表達(dá)的特定mAb的噬菌體顆粒并將其用于常規(guī)測(cè)定。與雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體展示已成功用于篩選和分離免疫球蛋白基因。2000年，Rader等人。首先描述了用噬菌體展示技術(shù)篩選兔單克隆抗體的全過程。該技術(shù)成功地用于針對(duì)結(jié)腸癌免疫治療的靶抗原人A33抗原的兔抗體的篩選和人源化，獲得的人源化抗體對(duì)人A33抗原具有高度特異性和親和力。目前，抗體噬菌體展示因其抗體生成速度快、易于制作以及體外控制各種選擇參數(shù)的能力，成為了產(chǎn)生用于治療目的的全人源抗體的主要技術(shù)平臺(tái)。

基于對(duì)抗體結(jié)構(gòu)、功能和序列多樣性的了解，人類還開發(fā)了一種新的合成抗體庫技術(shù)，并將其用于mAb生產(chǎn)，方法是將精確設(shè)計(jì)的序列插入抗原結(jié)合位點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)是基于基因復(fù)制IgG片段和使用分子生物學(xué)技術(shù)在體外使抗體互補(bǔ)位多樣化來實(shí)現(xiàn)的。幾個(gè)具有多個(gè)可變重鏈和輕鏈框架區(qū)的合成抗體文庫（例如HuCAL和Ylanthia文庫）被設(shè)計(jì)并用于分離針對(duì)分子識(shí)別優(yōu)化的人單克隆抗體。隨著文庫設(shè)計(jì)和選擇方法的進(jìn)步，合成抗體文庫將成為快速生成具有高特異性的靶向結(jié)合單克隆抗體不可或缺的工具。

3.單B細(xì)胞抗體技術(shù)

盡管雜交瘤篩選和顯示方法已用于兔單克隆抗體生產(chǎn)，但它們都存在一些缺點(diǎn)：雜交瘤技術(shù)細(xì)胞融合效率低，而展示方法導(dǎo)致重鏈和輕鏈的天然同源配對(duì)丟失。為了克服這些問題，最近開發(fā)了單B細(xì)胞抗體技術(shù)（圖1）。簡(jiǎn)而言之，單B細(xì)胞抗體技術(shù)包括以下簡(jiǎn)短步驟：（i）通過隨機(jī)方式或FACS從外周血或淋巴組織中鑒定和分離特定的單B細(xì)胞，（ii）單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）使用抗體特異性引物，（iii）使用PCR和測(cè)序擴(kuò)增Ig基因，（iv）將Ig基因克隆到表達(dá)載體中，（v）Ig基因在細(xì)菌系統(tǒng)（例如大腸桿菌）中表達(dá)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)（例如HEK293、CHO細(xì)胞），以及（vi）純化蛋白質(zhì)并使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估（圖1）。這種方法已廣泛用于人和小鼠單克隆抗體的生產(chǎn)，并產(chǎn)生了一些治療性中和單克隆抗體，用于治療多種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染病。例如，使用單B細(xì)胞抗體技術(shù)從HIV患者中分離出幾種有價(jià)值的mAb用于臨床診斷。這種方法最重要的優(yōu)點(diǎn)是保留了重鏈和輕鏈的天然同源配對(duì)，利用抗體親和力、特異性和成熟的自然過程。該技術(shù)有利于生成更高親和力、特異性和穩(wěn)定性的mAb。

記憶B細(xì)胞和漿/漿母細(xì)胞是產(chǎn)生抗體的主要來源。在人、小鼠和兔子的單B細(xì)胞抗體分析中采用的大多數(shù)方法都集中在記憶B細(xì)胞或漿/漿母細(xì)胞上。Kurosawa等人開發(fā)了一種基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的方法，用于使用FACS和ER特異性熒光染料鑒定和分離抗原特異性血漿/漿母細(xì)胞。該方法提高了血漿/漿母細(xì)胞的選擇效率，并消除了細(xì)胞繁殖和篩選過程。此外，Ozawa等人開發(fā)了一種芯片上的免疫斑點(diǎn)陣列測(cè)定技術(shù)來檢測(cè)兔抗原特異性mAb，并且該技術(shù)可以產(chǎn)生特異性識(shí)別人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-激活激酶1的磷酸化位點(diǎn)特異性表位的兔mAb。Clargo等人報(bào)道了一種基于熒光的方法與顯微操作相結(jié)合，以分離兔單抗原特異性IgG分泌漿細(xì)胞，用于抗體表達(dá)分析。此外，Seeber等人使用淋巴細(xì)胞淘選捕獲抗原特異性B細(xì)胞，結(jié)合體外B細(xì)胞短期培養(yǎng)和B細(xì)胞克隆，從外周血中分離功能性兔單克隆抗體。

兔淋巴細(xì)胞的分離由于缺乏有用的表面標(biāo)志物而受到限制。為了選擇稀有且特異性的兔B細(xì)胞進(jìn)行mAb表達(dá)，開發(fā)了幾種新方法。最近，Starkie等人描述了一種雙色抗原染色法，用于鑒定抗原特異性兔記憶B細(xì)胞，有效抗體鑒定率為38.5%。在這項(xiàng)工作中，陰性細(xì)胞染色用于消除T細(xì)胞、幼稚IgM+B細(xì)胞和死細(xì)胞，使用抗IgG和雙抗原標(biāo)記步驟（FITC和PE）進(jìn)行陽性細(xì)胞染色可以鑒定抗原特異性類別轉(zhuǎn)化的IgG⁺記憶B細(xì)胞亞群。這種將FACS技術(shù)與抗原結(jié)合步驟相結(jié)合，提高了抗原特異性mAb的回收率，因此具有高通量。此外，還開發(fā)了另一種簡(jiǎn)單靈活的方法HybriFree，并成功用于小鼠、兔和雞mAb的生產(chǎn)。HybriFree工作流程包括四個(gè)步驟：用裝載抗原的固體基質(zhì)捕獲抗原特異性B細(xì)胞、VH和VL編碼cDNA的單細(xì)胞擴(kuò)增、在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建組合VH-VL文庫以及確定合適的VH-VL組合。該方法在10天內(nèi)成功用于兔抗小鼠CD48單克隆抗體的高效制備，適用于任何抗體cDNA序列可用的物種。另一種用于兔mAb生產(chǎn)的稱為“單細(xì)胞RT-PCR連接體外表達(dá)（SICREX）”的新型篩選平臺(tái)。在這項(xiàng)工作中，通過顯微操作結(jié)合抗原偶聯(lián)磁珠分離抗原特異性B細(xì)胞，并使用線性Ig表達(dá)盒擴(kuò)增Ig基因以實(shí)現(xiàn)無細(xì)胞生產(chǎn)。線性表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的所有必需元件，包括T7啟動(dòng)子和T7終止子，抗原結(jié)合片段或單鏈可變片段無需克隆即可表達(dá)。與之前的平臺(tái)相比，SICREX的整個(gè)過程都是在體外進(jìn)行的，將mAb生產(chǎn)時(shí)間縮短到幾天。

最近，基于質(zhì)譜（MS）的從頭測(cè)序方法已被用于從血清來源的多克隆抗體庫中鑒定純化的mAb，這促進(jìn)了血清Ig的蛋白質(zhì)組學(xué)反卷積的發(fā)展。結(jié)合NGS和MS技術(shù)的進(jìn)步，該方法成功地用于測(cè)定兔免疫后多克隆血清反應(yīng)的抗體組成。在這種方法中，全長(zhǎng)血清IgG被純化并用胃蛋白酶處理以制備F（ab）₂片段，然后抗原特異性F（ab）₂分離片段并進(jìn)行蛋白水解消化，用于液相色譜高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）。同時(shí)，通過NGS測(cè)序構(gòu)建抗體庫數(shù)據(jù)。通過抗體數(shù)據(jù)庫作圖，鑒定出單個(gè)mAb。

參考文獻(xiàn)

Zhang Z, Liu H, Guan Q, et al. Advances in the isolation of specific monoclonal rabbit antibodies[J].Front. Immunol, 8: 494.

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